北京林業大學田硯亭教授

㈠ 植物組織培養小論文方向

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㈡ <菊芋的組織培養及植株再生>全文

摘要:本文針對植物組織培養中常見的褐變現象,詳細地分析了其產生的機理及影響因素,並提出了相應的對策,為科研和生產提供了一定的理論和實踐依據。

關鍵詞:植物組織培養，褐變，對策

目前，在許多植物組織培養過程中，常遇到褐變問題。褐變主

要發生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養以及原生質體的分離與培養中也經常發生。褐變產物不僅使外植體、細胞、培養基等變褐，而且對許多酶有抑製作用，從而影響培養材料的生長與分化，嚴重時甚至導致死亡。本文探討植物組織培養中褐變現象的影響因素、機理及防範措施，對我們進行科學研究或工廠生產，包括植物組織的培養,原生質體、懸浮細胞和植物器官的培養都有著十分重要的現實意義。

1褐變產生的影響因素

影響植物組織培養褐變的因子是復雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態等不同，褐變的程度也有所不同。

1.1植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關。

1.2外植體部位及生理狀態外植體的部位及生理狀態不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養中褐變的程度也不同。

1.3培養基成分培養基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關系。

1.4培養條件溫度過高或光照過強，均可加速被培養組織的褐變。不利環境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導程序化死亡的主要因素[1]。

2褐變產生的機理

2.1非酶促褐變

非酶促褐變是由於細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現象，並不涉及酚類物質的產生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉移到含NaCl的培養基中，組織周圍尤其是接觸培養基部分發生褐變，但培養基中沒有看到擴散的褐化物質。當溫度升高時繼代保存時間過長，也會發生此類現象。但這種褐變若採取適當措施或者愈傷組織適應了脅迫環境就不再發生了[3]。

2.2酶促褐變

目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變如同一般的酶促反應，其發生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養和繼代培養過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養材料褐變的關鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、芸香苷等），但並非所有的酚類物質都是PPO的底物。

在正常發育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在並不發生褐變，是因為在正常的組織細胞內由於多酚類物質分布在細胞的液泡內，而PPO則分布在各種質體或細胞質中，這種區域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結構發生變化和破壞時，則為酶創造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應，最後形成黑褐色物質，從而引起褐變。

3防止外植體產生褐變的對策

從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質——氧；二是捕捉或減少聚合反應的中間產物；三是抑制有關的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。

3.1適當外植體的選擇

取材時應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗表明，莖最容易誘導出愈傷組織，培養2周後長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產生愈傷組織，誘導出的愈傷組織全部褐變。

3.2對外植體的處理

通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質的毒害作用。處理方法如下：外植體經流水沖洗後，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70酒精消毒，然後接種於只含有蔗糖的瓊脂培養基中培養5-7天，使組織中的酚類物質部分滲入培養基中。取出外植體用0.1漂白粉溶液浸泡10分鍾，再接種到合適的培養基中。若仍有酚類物質滲出，3-5天後再轉移培養基2-3次，當外植體的切口癒合後，酚類物質減少，這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導率。

3.3適宜的培養基

培養基的成分與褐變程度有關，要考慮所選培養基的狀

態和類型。

3.3.1適當的無機鹽濃度張妙霞等[7]在柿樹組織培養防止褐變所進行的試驗中，4種培養基的無機鹽以改良MS(大量元素減半)和1/2MS的效果最好，MS的效果較差，結果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現象加重。

3.3.2適當和適量的激素王異星[5]在荔枝的組織培養過程中，培養基中添加1mg/LBA 0.5mg/L2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產生褐變。培養基中添加1mg/LBA 1mg/L2,4-D時，愈傷組織淺黃疏鬆，增殖也快。

3.3.3培養基的硬度在一定范圍內，瓊脂用量大，培養基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養基的硬度影響了酚類物質的擴散速度的緣故。

3.3.4培養基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴重,甚至會出現褐變死亡[8]。這可能是配製培養基的水改變了培養基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。

3.3.5培養基的pH值在水稻體細胞培養中，pH值為4.5-5.0時MS液體培養基可保持愈傷組織處於良好的生長狀態，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來說，酸性環境(pH值為4.5-5.0)不利於褐變過程的發生[10]。

3.3.6培養條件如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質的氧化，從而加速被培養的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環境中的CO2向細胞內擴散，細胞內CO32-增多，CO32-與細胞膜上的CO32-結合，使有效CO32-減少，導致內膜系統瓦解，酚類物質與PPO相互接觸，產生褐變[11]。因此，初期培養要在黑暗或弱光下進行。

3.4添加褐變抑制劑和吸附劑

褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產物醌發生作用，使其重新還原為酚[12]。由於其作用過程均為消耗性的，在實際應用中應注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產應用中可不受限制。在水稻細胞的培養基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產生抗氧化作用，使生色物質的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2 結合，從而降低了其活力。陳學森等[13]在對植酸在銀杏組織培養中應用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一種吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養基中的有害物質，包括瓊脂中的雜質、培養物在培養過程中分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糠醛等,從而有利於培養物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應注意，盡量用最低濃度的活性炭來對抗褐變的產生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質的同時，也會吸附培養基中的其他成分，對外植體的誘導分化會產生一定的負面影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質和細胞器的保護劑，可用於防止褐變[15]。

3.5進行細胞篩選和多次轉移

在組織培養過程中，經常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天後應立即轉移到新鮮培養基中，能減輕酚類物質對培養物的毒害作用，降低抑製作用，使外植體盡快分生，連續轉移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。

參考文獻：

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[9]金堅敏.水稻幼稿和成熟種子誘導胚狀體時的有關因子探討.植物學通報,1992.

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植物組織培養

植物組織培養即植物無菌培養技術，是根據植物細胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官、組織或細胞，如根、莖、葉、花、果實、種子、胚、胚珠、子房、花葯、花粉以及貯藏器官的薄壁組織、維管束組織等，在無菌和適宜的人工培養基及光照、溫度等條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最後形成完整的植株。至今，世界各國在無性系繁殖、花卉育種、植株脫病毒和種質保存等方面，廣泛應用組織培養技術。

（一）組織培養技求的應用

1．無性系繁殖無性系繁殖是植物組織培養應用的主流之一，用植物組織培養進行無性繁殖的優點是，用材少，速度快，不受氣候、季節、基質等自然條件的影響，比傳統的常規繁殖方法要快得多，人們又叫它'快速繁殖'或'微型繁殖'。其常見繁殖方式有短枝扦插、芽增殖、原球莖、器官分化和胚狀體發生。其中芽增殖在盆栽花卉繁殖中應用最為普遍，如草本植物四季秋海棠、雞冠花、萬壽菊、長春花，觀葉植物蟆葉秋海棠、網紋草、花葉芋、天鵝絨竹芋，木本植物三角花、比利時杜鵑、月季、八仙花等，在生產實踐中，均已取得較好的經濟效益。原球莖培養在大花蕙蘭、蝴蝶蘭、美麗兜蘭、石斛、春蘭等蘭科植物和腎蕨、鳳尾蕨、鹿角蕨等觀賞蕨的規模性生產中得到廣泛應用。胚狀體培養，據報道目前已在30個科150種植物上觀察到它們的愈傷組織可以分化出胚狀體，而盆栽花卉中的花葉芋、山茶花都是成功的範例。器官分化主要是從外植體直接產生不定芽或不定根，一般不通過從愈傷組織進行器官分化形成植株，因為其性狀有可能發生變化或經過多次繼代培養後，會喪失再生植株的能力。

2．花卉育種當今盆栽花卉育種中，也廣泛應用組培技術。

胚培養：在花卉種間雜交或遠緣雜交中，有時雖然能正常受精，但胚往往發育不完全或胚與胚乳間不親和，不能得到種子，可採用胚的早期離體培養促使胚正常發育，培養出雜交後代。如山茶花、百合和鳶尾雜交中均採用幼胚培養，成功地收到了雜交種子。同時，在雜交中受精困難，也可把未受精的胚珠分離出來，在試管內用花粉受精來解決，這在草本花卉花菱草中已取得成功。

單倍體育種：利用花葯培養誘導花粉形成單倍體，在試管培養中通過秋水仙素處理，使染色體加倍，而成為純合二倍體植物，從而縮短新品種育種的時間，還有利於突變中隱性突變的分離。這在花卉的株型、花色、花型的大小或重瓣，葉型、葉色等產生變異，往往有直接利用價值。這在矮牽牛的育種中已應用。

體細胞雜交和植物基因工程：利用原生質體遺傳操作技術，可以從原來不大可能進行雜交的不同屬植物間獲得體細胞雜種或核質雜種。可以通過攝取外源目的基因，定向改造植物的某些重要性狀。

3．植株脫病毒用無性繁殖方法來繁衍的花卉種類如菊花、香石竹、鬱金香、百合、白鶴芋等，不能通過種子途徑去除病毒，用化學方法防治和高溫處理往往成效不穩定。作為組織培養的無性繁殖材料，最好是去病毒組織，否則易導致病毒積累，危害加重。而植物的莖尖部分無維管束，病毒難以侵入。所以，莖尖培養是獲得無病毒植株的最好途徑。至今，莖尖培養脫毒法已在菊花、百合、香石竹、鬱金香等盆栽花卉上推廣使用。

4．種質保存用無性繁殖的植物，因沒有種子，只能在植物園內長期栽培保存，耗費大量的土地和勞力。種質材料還易受自然環境的變化和病蟲危害而流失。若用組織培養方法，保存愈傷組織、胚狀體、莖尖等組織，可節省大量人力和物力。

（二）組織培養的幾個步驟

1．材料的選用一般用於組織培養的材料稱為外植體。常分為兩類。一類是帶芽的外植體，如莖尖、側芽、鱗芽、原球莖等，組織培養過程中可直接誘導叢生芽的產生。其獲得再生植株的成功率較高，變異性也較小，易保持材料的優良性狀。另一類主要是根、莖、葉等營養器官和花葯、花瓣、花軸、花萼、胚珠、果實等生殖器官。這一類外植體需要一個脫分化過程，經過愈傷組織階段，再分化出芽或產生胚狀體，然後形成再生植株。

外植體的取用與組織部位、植株年齡、取材季節以及植株的生理狀態、質量，都對培養時器官的分化有一定影響。一般階段發育年幼的實生苗比發育年齡老的栽培品種容易分化，頂芽比腋芽容易分化，萌動的芽比休眠芽容易分化。在組織培養中，最常用的外植體是莖尖，通常切塊在0．5厘米左右，太小產生愈傷組織的能力差，太大則在培養瓶中占據空間太多。培養脫毒種苗，常用莖尖分生組織部，長度為0．1毫米以下。

2．外植體的消毒植物組培能否取得成功的重要因素之一，就是保證培養物在無菌條件下安全生長。為此，必須抓好外植體的消毒和實行無菌操作。

由於培養的植物材料大都採集於田間栽培植株，材料上常附有各種微生物，一旦被帶入培養基，即會迅速繁殖滋長，造成污染，培養失敗。所以培養前必須對外植體進行嚴格的消毒處理，消毒的尺度為既能全都殺滅外植體上附帶的微生物，但又不傷害材料的生活力。因此，必須正確選擇消毒劑和使用的濃度、處理時間及程序。目前，常用的消毒劑有次氯酸鈣、氯化汞、次氯酸鈉、雙氧水、酒精（70％）等。具體消毒方法如下：

（1）莖尖、莖、葉片的消毒消毒前先用清水漂洗干凈或用軟毛刷將塵埃刷除，茸毛較多的用皂液洗滌，然後再用清水洗去皂液，洗後用吸水紙吸干表面水分，用70％酒精浸數秒鍾，取出後及時用10％次氯酸鈣飽和上清液浸泡10～20分鍾。或用2％～10％次氯酸鈉溶液浸泡6～15分鍾。消毒後用無菌水沖洗3次，用無菌紗布或無菌紙吸干接種。

（2）根、塊莖、鱗莖的消毒這類材料大都生長在土中，常帶有泥土，挖取時易遭損傷。消毒前必須先用凈水清洗干凈，在凹凸不平處以及鱗片縫隙處，均用毛筆或軟刷將污物清除干凈，用吸水紙吸干後，在70％酒精中浸一下，然後用6％～10％次氯酸鈉溶液浸5～15分鍾，或用0．1％～0．2％氯化汞消毒5～10分鍾，最後用無菌水清洗3～4次，用無菌紗布或無菌紙吸干後接種。

（3）果實、種子的消毒這類材料有的表皮上具有茸毛或蠟質，消毒前先用70％酒精浸泡幾秒鍾或2～10分鍾，然後用飽和漂白粉上清液消毒10～30分鍾或2％次氯酸鈉溶液浸10～20分鍾，消毒後去除果皮，取出內部組織或種子接種。直接用種子或果實消毒，經消毒後的材料均須用無菌水多次沖洗後接種。

（4）花葯、花粉的消毒植物的花葯外面常被花瓣、花萼包裹著，一般處於無菌狀態，只需採用表面消毒即可接種。通常先用70％酒精棉球擦拭花蕾或葉鞘，然後將花蕾剝出，在飽和漂白粉上清液中浸泡10～15分鍾，用無菌水沖洗2～3次，吸干後即可接種。

3．組織培養的條件接種後的培養容器置放培養室，室溫應控制在23～26℃，每天12～16小時光照，光照度為1000～3000勒克斯。

4．外植體的增殖接種後的外植體要分化出叢狀芽、愈傷組織或胚狀體，必須對培養基及激素的種類和濃度進行嚴格的設計和篩選。常用的基本培養基為MS培養基，激素的種類和濃度對外植體的分化和增殖起到重要的作用。也就是說不同的花卉種類對激素的種類和濃度是有差別的（表4－－3）。

5．誘導生根繼代培養形成的不定芽和側芽等一般沒有根，要促使試管苗生根，必須轉移到生根培養基上，生根培養基一般應用1／2MS培養基，因為降低無機鹽濃度有利於根的分化。同時，不同盆栽花卉誘導生根時所需要的生長素的種類和濃度是不同的（表4－4）。一般常用吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）三種。一般在生根培養基中培養1個月左右即可獲得健壯根系。

6．組培苗的移栽生根或形成根原基的試管苗從無菌，溫、光、濕度穩定環境中進入到自然環境中，從異養過渡到自養過程，必須經過一個煉苗過程。首先打開試管瓶塞放陽光充足處讓其鍛煉1～2天，然後取出幼苗用溫水將瓊脂沖洗掉，移栽到泥炭、珍珠岩、蛭石、礱糠灰等組成的基質中，基質使用前需高溫消毒，移栽後要適當遮蔭，可用塑料薄膜覆蓋，保持較高空氣濕度，溫度維持在25℃左右，勿使陽光直曬，7～10天後要注意通風和補充澆水，約20～40天，新梢開始生長後，小苗可轉入正常管理。

㈢ 劉青林的論文著作

【研究論文】
1. 劉青林，李蓮梅.鵝掌楸苗期生長過程分析.西北植物學報，1988，8(5)：98～99
2. 劉青林，田硯亭，吳滌新. 花卉的體細胞無性系變異及其在育種上的應用.北京林業大學學報，1992，14(2)：90～97
3. 劉青林.植物園的現代化之管見.見：張治明主編.中國植物園（第1期）. 北京：中國科學技術出版社，1994.15～17
4. 劉青林，劉西俊，王淑燕.中國花卉育種的進展.中國植物園（第1期）. 北京：中國科學技術出版社，1994.73～77
5. 吳滌新，劉青林.幾種自然乾花花材品質的研究.北京林業大學學報，1994，16(1)：110～113
6. 劉青林，吳滌新，田硯亭. 鳶尾體細胞無性系的建立與變異.西北植物學報，1994，14(4)：267～272
7. Liu Qinglin, Wu Dixin, Tian Yanting. Preliminary report on inced mutation of iris somaclones. Acta Horticulturae,1995, 404: 91～94
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10. 劉青林.梅花起源與品種演化問題初探.北京林業大學學報.1996，18(2)：78～82
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